水產(chǎn)動(dòng)物病原菌藥敏試驗(yàn)

十二少

臨床微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的方法主要有紙片擴(kuò)散法，稀釋法（包括瓊脂和肉湯稀釋法），抗生素濃度梯度法（E-test法），和自動(dòng)化儀器等。水產(chǎn)微生物最常用到的是紙片擴(kuò)散法。

紙片擴(kuò)散法：

該法是將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測(cè)試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴(kuò)散，隨著擴(kuò)散距離的增加，抗菌藥物的濃度呈對(duì)數(shù)減少，從而在紙片的周圍形成濃度梯度。

同時(shí)，紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的菌株不能生長(zhǎng)，而抑菌范圍外的菌株則可以生長(zhǎng)，從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈，不同的抑菌藥物的抑菌圈直徑因受藥物在瓊脂中擴(kuò)散速度的影響而可能不同，抑菌圈的大小可以反映測(cè)試菌對(duì)藥物的敏感程度，并與該藥物對(duì)測(cè)試菌的MIC（最小抑制濃度）呈負(fù)相關(guān)。



一、實(shí)驗(yàn)材料
1、培養(yǎng)基：
目前水產(chǎn)常用的有以下幾種



2、藥敏試紙：購(gòu)買或自制（詳見實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備）

3、細(xì)菌：待做藥敏試驗(yàn)的細(xì)菌（包括水產(chǎn)動(dòng)物病變組織、體液或已分離培養(yǎng)的菌種等）

4、儀器：解剖剪、鑷子、接種環(huán)、酒精燈、移液器、滴頭。

二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1、藥液的制備：按商品藥的使用治療量的比例配制藥液，如取“氟多力”80～100微克加入1ml的水中混勻，可按這個(gè)比例配制藥液。此稀釋液即為用于做藥敏試驗(yàn)的藥液。

2、藥敏片的準(zhǔn)備

1）取定性濾紙，用打孔機(jī)打成6毫米直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔干燥的空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎。經(jīng)15磅15～20分鐘高壓消毒后，放在37℃溫箱或烘箱中數(shù)天，使完全干燥。

2）在上述含有50片紙片的瓶?jī)?nèi)加入藥液0.25毫升，并翻動(dòng)紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動(dòng)紙片時(shí)不能將紙片搗爛。同時(shí)在瓶口上記錄藥物名稱，放37℃溫箱內(nèi)過(guò)夜，干燥后即密蓋，如有條件可真空干燥。切勿受潮，置陰暗干燥處存放，有效期3～6個(gè)月。

三、實(shí)驗(yàn)操作方法

1、細(xì)菌涂布

1）取病變組織或體液（肝、脾、腎，腸膿液等），輕輕在平板上均勻涂一層。

具體方式：用滅菌解剖剪和鑷子，剪取動(dòng)物病變組織；或用滅菌棉拭子蘸取病變部位體液，在平板上輕輕涂布均勻。此方法適合臨床快速確定選擇用藥。

2）若已做細(xì)菌分離培養(yǎng)，可直接用經(jīng)酒精燈火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細(xì)菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細(xì)菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式：用滅菌接種環(huán)取適量細(xì)菌分別在平皿邊緣相對(duì)四點(diǎn)涂菌，以每點(diǎn)開始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點(diǎn)劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細(xì)菌均勻密布于平皿。（另：可挑取待試細(xì)菌于少量生理鹽水中制成細(xì)菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細(xì)菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密，直接懸液法要把菌液濃度用生理鹽水或PBS調(diào)到0.5個(gè)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)再涂布均勻。）

2、貼藥敏片

將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準(zhǔn)確的觀察結(jié)果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上；一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若干片（外周一般可貼七片），每種藥敏片的名稱要在培養(yǎng)皿上標(biāo)注。

3、培養(yǎng)
將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察效果。

四、結(jié)果觀察

在涂有細(xì)菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴(kuò)散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內(nèi)的細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制。過(guò)夜培養(yǎng)后形成一個(gè)抑菌圈，抑菌圈越大，說(shuō)明該菌對(duì)此藥敏感性越大，反之越小，若無(wú)抑菌圈，則說(shuō)明該菌對(duì)此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細(xì)菌濃度有直接關(guān)系。

五、判定標(biāo)準(zhǔn)

藥敏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，應(yīng)按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標(biāo)準(zhǔn)。



具體對(duì)于不同的菌株，及不同的抗生素紙片需參照NCCLs的標(biāo)準(zhǔn)或者CLSI標(biāo)準(zhǔn)。

六、應(yīng)用

藥物敏感實(shí)驗(yàn)后，應(yīng)選擇高敏藥物進(jìn)行治療，也可選用兩種藥物協(xié)助使用，以減少耐藥菌株。在選擇高敏藥物時(shí)應(yīng)考慮藥物的吸收途徑，因?yàn)槲覀兯幟魧?shí)驗(yàn)是藥液直接和細(xì)菌接觸，而在給水產(chǎn)動(dòng)物用藥的時(shí)候，必須通過(guò)機(jī)體的吸收才能使藥物達(dá)到一定的效果，所以在治療水產(chǎn)動(dòng)物疾病時(shí)，高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法，這樣才會(huì)達(dá)到好的治療效果。


來(lái)源：利洋服務(wù)

十二少

leikunnuy：
牛��！一個(gè)培養(yǎng)皿上能放12種藥敏片。

十二少

lwr2012：
這個(gè)是大的培養(yǎng)皿，估計(jì)是90的，研究所一般用的都是60的吧？

十二少

沙湖雙黃蛋回復(fù)leikunnuy：
“牛��！一個(gè)培養(yǎng)皿上能放12種藥敏片。"

恩，現(xiàn)在公司發(fā)給我們的這東西，長(zhǎng)期藥敏片用完了，培養(yǎng)基還用不到一半

十二少

leikunnuy回復(fù)lwr2012：
”這個(gè)是大的培養(yǎng)皿，估計(jì)是90的，研究所一般用的都是60的吧？“

我們做藥敏試驗(yàn)也是用的90cm的玻璃培養(yǎng)皿的。

十二少

leikunnuy：
藥敏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的判斷，還應(yīng)該考慮藥敏片抗生素的濃度的。有些藥敏片抗生素的濃度是不一樣的。

十二少

水中寶：
微生物試驗(yàn)中病原菌的人工培養(yǎng)溫度一般為35-37℃，培養(yǎng)時(shí)間多數(shù)為18-24h，但有時(shí)也要根據(jù)菌種及培養(yǎng)目的做最佳選擇。比如鏈球菌、愛德華氏菌最適生長(zhǎng)溫度為37℃，弧菌一般30℃下培養(yǎng)，氣單胞菌屬一般在28℃培養(yǎng)，假單胞菌15-20℃生長(zhǎng)最好。至于哪一種菌在此溫度下能不能培養(yǎng)出來(lái)，最終還是要看實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

上述數(shù)據(jù)只是查閱相關(guān)資料總結(jié)出來(lái)供大家學(xué)習(xí)參考，有些不完善的地方歡迎糾錯(cuò)補(bǔ)漏。

較真的水貨

利洋的店都有藥敏做嗎？

leikunnuy

較真的水貨 發(fā)表于 2013-7-26 09:20
利洋的店都有藥敏做嗎？

都有的，基本上都有做。

Dannyhuang

能貼那么多紙片嗎？

白云飛雪

知道了敏感藥物，用藥劑量怎么得出？

lonelyfish

藥敏試驗(yàn)結(jié)果只能作為臨床處方的參考，如果試驗(yàn)結(jié)果為耐藥，那么臨床就不要使用，如果是敏感，可以在詢問(wèn)用藥史的前提下選擇使用。關(guān)于菌株的培養(yǎng)溫度，最好是選擇菌株來(lái)源地的水溫，或者28℃。至于藥敏試驗(yàn)結(jié)果的判定參照標(biāo)準(zhǔn)，參照CLSI是沒有錯(cuò)的，但是CLSI推薦使用的培養(yǎng)基大多為MH培養(yǎng)基，只有在此培養(yǎng)基和其建設(shè)采用的溫度下才能參照CLSI的抑菌圈解釋標(biāo)準(zhǔn)。

白慕水

專業(yè)圍觀學(xué)習(xí)

牧心

我以前做了兩年的魚病藥敏實(shí)驗(yàn)，我們是先從肝臟、腹水、血液中用接種環(huán)劃線，然后把細(xì)菌洗下來(lái)，然后再均勻涂布后貼紙片。今天拿來(lái)，后天出結(jié)果。有時(shí)候客戶比較急，且魚有大量腹水時(shí)，就直接涂布，也會(huì)有細(xì)菌長(zhǎng)。最難以保證的的兩個(gè)問(wèn)題是：長(zhǎng)出來(lái)的有多少比例是病原菌；藥敏紙片的濃度該多少。有人說(shuō)肝臟、腹水里面本來(lái)都是無(wú)菌的，如果有細(xì)菌長(zhǎng)的話，應(yīng)該是病原菌的比例比較大。藥敏紙片的濃度我們都是超過(guò)最低抑菌濃度，做定性。不過(guò)有些藥確實(shí)挺厲害，對(duì)每種細(xì)菌抑制效果都不錯(cuò)。藥敏對(duì)臨床僅做參考，如果完全按照藥敏結(jié)果配藥，可能只有50%的把握。