蝦肝腸胞蟲(chóng)和IHHNV病原竟然這些地方都有！

　　中國(guó)水產(chǎn)頻道獨(dú)家報(bào)道，針對(duì)養(yǎng)殖戶反映的南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢的現(xiàn)象，本研究采用 EHP（蝦肝腸胞蟲(chóng)）和 IHHNV（傳染性皮下及造血組織壞死病毒）實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（RT-PCR）檢測(cè)方法，對(duì)粵西地區(qū)的南美白對(duì)蝦親蝦、蝦苗、成蝦、餌料、鮮活餌料和育苗與養(yǎng)殖水體進(jìn)行檢測(cè)，分析這兩種病原在種苗生產(chǎn)與對(duì)蝦養(yǎng)殖中的流行情況。

　　

　　一、材料與方法

　　

　　1、試驗(yàn)材料

　　

　　本試驗(yàn)用到的蝦苗、種蝦、成蝦、種蝦餌料和育苗與養(yǎng)殖用水樣品均由湛江恒興南方海洋科技有限公司實(shí)驗(yàn)室收集，樣品分別采自于粵西區(qū)域的育苗與養(yǎng)殖場(chǎng)。

　　

　　EHP熒光定量 PCR檢測(cè)試劑盒，熒光定量 PCR儀（TL988），解剖剪等。

　　

　　2、試驗(yàn)方法

　　

　　（1）樣品處理

　　

　　蝦苗：用生理鹽水沖洗蝦苗表面3次以上，隨機(jī)挑取 10尾，置于玻璃研磨器中充分研磨后，用磁珠法提取DNA。親蝦、成蝦：分別取鮮活蝦體的肝胰臟 0.1g（約黃豆大�。�，同上。種蝦餌料：取種蝦餌料 0.1g，同上。水樣：分別量取 80mL的水樣，高速離心8min，棄上層清夜；吸取 1mL生理鹽水，充分懸浮沉淀，轉(zhuǎn)入 1.5mL的 EP管中，高速離心5min，棄上層清夜，同上。

　　

　�。�2） EHP熒光定量 PCR檢測(cè)

　　

　　以上述提取的 DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光 PCR檢測(cè)。20μL反應(yīng)體系，參照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配置。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性 2min；94℃變性10S，60℃退火 30S（此處采集熒光，設(shè)置為 FAM綠色熒光），共 40個(gè)循環(huán)。

　　

　　二、結(jié)果與分析

　　

　　1、多種樣品的 EHP和 IHHNV檢測(cè)結(jié)果

　　

　　用 RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)粵西地區(qū)的有關(guān)南美白對(duì)蝦樣品進(jìn)行 EHP和IHHNV檢測(cè)，結(jié)果匯總后如表 1所示。從表1中可知，共檢測(cè)的 87份樣品中，EHP的檢出率為41.38%，IHHNV的檢出率為 12.18%。EHP檢出率較高的為成蝦和種蝦樣品，分別為 93.75%和66.67%。同樣，IHHNV檢出率也較高分別為 31.25%和38.10%。其中未經(jīng)處理過(guò)的 2份海水樣品均有檢出 EHP和IHNNV，但經(jīng)過(guò)消毒處理后的育苗與養(yǎng)殖用水未檢測(cè)到 EHP和IHHNV。

　　

　　2、進(jìn)口樣品與本地樣品的 EHP和IHHNV檢測(cè)結(jié)果

　　

　　分別對(duì)進(jìn)口種蝦、進(jìn)口一代苗、本地種蝦和本地蝦苗進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。從表 2可知，6份進(jìn)口種蝦樣品中，EHP檢出率較低為 33.33%，且未檢測(cè)到 IHHNV。同樣，進(jìn)口的一代苗中，EHP檢出率為30.00%，IHHNV的檢出率較低，為 10%。本地種蝦的 EHP和IHHNV檢出率最高，分別為 80.00%和53.33%。本地蝦苗的 EHP檢出率為21.74%，IHHNV檢出率為34.78%。

　　

　　3、不同成蝦樣品的 EHP和 IHHNV檢測(cè)結(jié)果

　　

　　為了探究南美白對(duì)蝦感染 EHP和IHHNV對(duì)生長(zhǎng)的影響，筆者對(duì)不同養(yǎng)殖環(huán)境（不同養(yǎng)殖場(chǎng)）、不同養(yǎng)殖時(shí)長(zhǎng)和不同規(guī)格的對(duì)蝦樣品進(jìn)行了上述病原的檢測(cè)。不同養(yǎng)殖場(chǎng)成蝦檢測(cè)結(jié)果如表3所示，A養(yǎng)殖場(chǎng)的腸胞蟲(chóng)載量最高，對(duì)蝦平均日增長(zhǎng)體重（簡(jiǎn)稱“日增長(zhǎng)量”）最低為 0.039g。C養(yǎng)殖場(chǎng)的腸胞蟲(chóng)含量最少，其平均日增長(zhǎng)量比其它兩個(gè)場(chǎng)的高，為 0.090g。3個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的樣品均未檢測(cè)出IHHNV。

　　

　　B養(yǎng)殖場(chǎng)不同養(yǎng)殖時(shí)長(zhǎng)對(duì)蝦的檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表 4）。3份樣品都有檢出EHP，其日增長(zhǎng)量最大的 B-24樣品，EHP載量相對(duì)最低；而日增長(zhǎng)量最小的 B-17樣，EHP載量相對(duì)最高。另在B-23的樣品中有檢出IHHNV。

　　

　　B養(yǎng)殖 20號(hào)池不同規(guī)格對(duì)蝦（養(yǎng)殖時(shí)間 116天）的檢測(cè)結(jié)果如表 5所示，EHP的載量指數(shù)（ERCEHP）相同；其平均日增長(zhǎng)量為其成蝦樣品中沒(méi)有檢測(cè)到IHHNV。

　　

　　根據(jù)以上檢測(cè)對(duì)蝦的養(yǎng)殖時(shí)長(zhǎng)和體重以及對(duì)其 EHP的檢測(cè)結(jié)果，得到日增長(zhǎng)量與 EHP載量指數(shù)（ERCEHP）的關(guān)系圖（見(jiàn)圖 1）。從圖中可見(jiàn)對(duì)蝦的日增長(zhǎng)量與 EHP載量指數(shù)呈一定的對(duì)數(shù)關(guān)系（R2=0.5746）。

　　

　　三、討論

　　

　　近年來(lái)，腸胞蟲(chóng)在全球南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)中流行范圍很廣，先后在泰國(guó)、馬來(lái)西亞、印度等國(guó)檢測(cè)出該病原，在我國(guó)江蘇沿海和廣東沿海地區(qū)也多有檢出。2015年浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣站對(duì)浙江地區(qū)的 134份蝦苗樣品進(jìn)行檢測(cè)，EHP的檢出率高達(dá)53.8%，HHNV的檢出率為 25.4%；江蘇沿海地區(qū)南美白對(duì)蝦 EHP的發(fā)病率約為 25%。本研究對(duì)粵西區(qū)域的 87份樣品進(jìn)行檢測(cè)，EHP的檢出率為41.38%，IHHNV的檢出率為 12.18%。另在檢測(cè)樣品中，兩份不同海域的海水樣品有檢測(cè)到 EHP和 IHNNV，而經(jīng)過(guò)消毒處理過(guò)的養(yǎng)殖用水和育苗用水中未檢測(cè)出上述病原，可見(jiàn)事先進(jìn)行水處理對(duì)養(yǎng)殖和育苗的重要性。EHP和 IHHNV的檢出率較高的為成蝦樣品，可見(jiàn)在成蝦養(yǎng)殖過(guò)程中最容易感染到該兩種病原。分別對(duì)粵西地區(qū)進(jìn)口種蝦和本地選育種蝦進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)進(jìn)口種蝦中 EHP的檢測(cè)率為33.33%，沒(méi)有檢出 IHHNV；而在一代苗中，IHHNV檢出率為 10.00%，說(shuō)明在對(duì)蝦在幼體生產(chǎn)及育苗過(guò)程中感染到了IHHNV。

　　

　　從本文對(duì)不同養(yǎng)殖場(chǎng)、不同養(yǎng)殖時(shí)長(zhǎng)和不同規(guī)格對(duì)蝦的檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)：3個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的對(duì)蝦 EHP載量差異大，EHP載量高的對(duì)蝦日增長(zhǎng)量最小，而日增量大的 EHP載量底；在 B養(yǎng)殖場(chǎng)不同時(shí)長(zhǎng)的對(duì)蝦檢測(cè)結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖時(shí)長(zhǎng)與 EHP載量沒(méi)有相關(guān)性，其感染量基本相同；B養(yǎng)殖 20號(hào)池不同規(guī)格的對(duì)蝦 EHP載量指數(shù)一致。綜上所述，對(duì)蝦 EHP的載量與養(yǎng)殖環(huán)境有緊密聯(lián)系，環(huán)境不同其 EHP的載量指數(shù)不同。因此在對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中，養(yǎng)殖水體、飼養(yǎng)餌料以及養(yǎng)殖工具等環(huán)境因素的嚴(yán)格把關(guān)，對(duì)控制對(duì)蝦感染 EHP病原極為重要。

　　

　　對(duì)蝦日增長(zhǎng)量與 EHP載量指數(shù)呈一定的對(duì)數(shù)關(guān)系（R病毒 =0.5746），EHP載量指數(shù)增大，日增長(zhǎng)量呈對(duì)數(shù)下降。結(jié)果與劉珍的試驗(yàn)結(jié)果稱負(fù)相關(guān)性吻合。但由于試驗(yàn)局限，R 2較低，有待后期試驗(yàn)進(jìn)一步的優(yōu)化。