溫和氣單胞菌對(duì)氟苯尼考的耐藥性獲得和消失速率

　　中國(guó)水產(chǎn)頻道報(bào)道，對(duì)人工養(yǎng)殖黃顙魚（Ictalurus punctatus Rafinsque）能造成嚴(yán)重危害的致病菌種類較多，如溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）已經(jīng)被證明能引起黃顙魚發(fā)生細(xì)菌性潰瘍病。在黃顙魚的人工養(yǎng)殖過程中，對(duì)由致病細(xì)菌引起的各種疾病，養(yǎng)殖業(yè)者一般會(huì)采用各種抗菌素類藥物進(jìn)行治療。在同一個(gè)養(yǎng)殖水體中多次使用同種或者同類抗菌素會(huì)導(dǎo)致病原菌耐藥性的增加，導(dǎo)致藥物治療水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病變得很困難。此外，抗菌藥物的大量使用還可能造成養(yǎng)殖魚體內(nèi)的藥物殘留超標(biāo)，嚴(yán)重時(shí)還可能引起公共衛(wèi)生方面的問題。

　　

　　不同種類的致病菌對(duì)抗菌素產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制不同，而且耐藥性產(chǎn)生速度和消失速率也是有所不同的。了解致病菌對(duì)抗菌素耐藥性的產(chǎn)生和消失速率，是決定抗菌素藥物的正確使用程序和方法的基礎(chǔ)，本研究在離體條件下，檢測(cè)了從患病黃顙魚上分離的A.sobria菌株對(duì)氟苯尼考的耐藥性獲得與消失速率，旨在為制定這種抗菌素在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病治療中的科學(xué)用藥程序提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

　　

　　1 材料與方法

　　

　　1.1 供試藥物

　　

　　將氟苯尼考（Florfenicol，Rochi，批號(hào)：130316，購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）作為本研究的供試藥物。

　　

　　1.2 供試菌株

　　

　　2012年5~6月和2013年3~5月，從江蘇省射陽縣黃沙港養(yǎng)殖區(qū)和浙江省菱湖地區(qū)的養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)的患病黃顙魚體內(nèi)，分離的A.sobria HS-120606和HS-130309等2個(gè)菌株被用于本研究。菌株分離的時(shí)間、地點(diǎn)和病魚器官等詳細(xì)情況見表1。

　　

　　表 1 供試菌株的來源

　　1.3 供試菌株最小抑菌濃度的測(cè)定

　　

　　按照日本化學(xué)療法學(xué)會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)法，首先將氟苯尼考用滅菌生理鹽水分別稀釋至1,000.0mg/L的濃度。然后在無菌條件下，用滅菌后的FWA液體培養(yǎng)基將藥物稀釋10倍，從而使培養(yǎng)基中藥物的濃度達(dá)到100.0mg/L的濃度。再用定量移液槍向每支盛有2.9mL胰蛋白胨液體培養(yǎng)基的試管中加入2.9mL含有藥物的培養(yǎng)基，將試管在混懸器上混合均勻后，從中吸取2.9mL含有藥物的FWA液體培養(yǎng)基加到下一試管中，以此類推制作成藥物濃度分別為100.0mg/L、50.0mg/L、25.0mg/L……0.025mg/L的2倍稀釋藥物系列培養(yǎng)基試管。最后，定量吸取0.1mL濃度約為1.2×106cfu/mL活菌液（比濁法測(cè)定）加入上述每支試管中，搖勻。置于25℃條件下培養(yǎng)72h，經(jīng)肉眼觀察證實(shí)無細(xì)菌生長(zhǎng)試管中的最低藥物濃度，即為藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

　　

　　1.4 供試菌株耐藥性獲得速率的測(cè)定

　　

　　在上述測(cè)定的氟苯尼考對(duì)A.sobria的藥敏試管中，從肉眼觀察有細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度的試管中吸取0.1mL培養(yǎng)基，將其接種在含有不同濃度氟苯尼考的FWA液體培養(yǎng)基試管中，在25℃條件下培養(yǎng)72h后，從經(jīng)肉眼觀察證實(shí)有細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度的試管中，吸取0.1mL培養(yǎng)基分別按照1.3項(xiàng)的方法測(cè)定氟苯尼考對(duì)其中A.sobria的MIC。上述相同的操作連續(xù)進(jìn)行9次，即使A.sobria在含有氟苯尼考的藥物培養(yǎng)基中傳代9次，將最后測(cè)定的MIC與最初的MIC比較，評(píng)價(jià)A.sobriae菌株對(duì)氟苯尼考耐藥性獲得速率。

　　

　　1.5 供試菌株耐藥性消失速率的測(cè)定

　　

　　將在藥物培養(yǎng)基中經(jīng)過連續(xù)傳代9次，證明其均已經(jīng)獲得較高耐藥性的A.sobria2個(gè)菌株，以瓊脂內(nèi)穿刺法將其分別接種在盛有不含氟苯尼考的FWA瓊脂培養(yǎng)基的試管中，至于在4℃條件下保存，每間隔20d以同樣的方法傳代1次，連續(xù)傳代5次。按照1.3項(xiàng)的方法測(cè)定氟苯尼考對(duì)每次傳代后培養(yǎng)基中A.sobria的MIC。將對(duì)傳代5次后測(cè)定的MIC與最初的MIC比較，評(píng)價(jià)A.sobria菌株對(duì)氟苯尼考耐藥性消除速率。

　　

　　2 結(jié)果

　　

　　2.1 供試菌株對(duì)氟苯尼考的敏感性

　　

　　氟苯尼考對(duì)A.sobria2個(gè)菌株MIC的測(cè)定結(jié)果如表2所示。由表2的結(jié)果可見氟苯尼考對(duì)2個(gè)菌株的MIC均為分別為0.20mg/L和0.78mg/L。

　　

　　表2 溫和氣單胞菌對(duì)氟苯尼考的敏感性

　　2.2 供試菌株對(duì)氟苯尼考耐藥性產(chǎn)生速率

　　

　　A.sobria的2個(gè)菌株經(jīng)過連續(xù)9次在帶有氟苯尼考的FWA液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，菌株對(duì)氟苯尼考耐藥性變化的狀況如表3所示。由表3可以看出，2個(gè)菌株在含有氟苯尼考的液體培養(yǎng)基中傳代9次后，均獲得了比較強(qiáng)的耐藥性，其中HS-120606菌株的MIC由0.20mg/L上升到了0.78mg/L，即MIC值上升了4倍；而HS-130309菌株的MIC由0.78mg/L上升到了6.25mg/L，即MIC值上升了8倍。

　　

　　2.3 供試菌株對(duì)氟苯尼考耐藥性消除速率

　　

　　將獲得了較強(qiáng)耐藥性A.sobria的2個(gè)菌株在不含氟苯尼考的FWA瓊脂培養(yǎng)基中連續(xù)5次傳代培養(yǎng)后，菌株對(duì)氟苯尼考耐藥性變化的狀況如表4所示。由表4可以看出，2個(gè)菌株在不含有氟苯尼考的FWA瓊脂培養(yǎng)基中經(jīng)過傳代5次，耐藥性逐漸下降，其中HS-120606菌株的MIC值由0.78mg/L下降到了0.39mg/L，而HS-130309菌株的MIC值由6.25mg/L下降到了1.56mg/L。

　　

　　3 討論

　　

　　在我國(guó)，現(xiàn)在已經(jīng)有比較多的抗菌素類藥物被批準(zhǔn)作為水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病的治療藥物（已經(jīng)獲得農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)生產(chǎn)的抗菌素類漁藥達(dá)到25種）。但是，這些藥物從漁藥生產(chǎn)企業(yè)用于申請(qǐng)生產(chǎn)許可證的技術(shù)資料，到漁藥被水產(chǎn)養(yǎng)殖者使用的各個(gè)環(huán)節(jié)都還存在一些問題。如漁藥企業(yè)在申請(qǐng)生產(chǎn)某種抗菌素藥類漁藥時(shí)，所提供的申請(qǐng)技術(shù)資料大多只有藥物對(duì)某些水產(chǎn)動(dòng)物致病菌的抑、殺菌效果的相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而沒有提供藥物的在對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物使用的過程中，致病菌對(duì)藥物耐藥性產(chǎn)生變化的相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；又如由于我國(guó)的水產(chǎn)獸醫(yī)制度尚未建立起來，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者在選擇某種漁藥作為水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病治療藥物時(shí)，因?yàn)闆]有針對(duì)致病菌（從需要用藥的患病水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)分離的致病菌）的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為選擇漁藥和使用劑量的依據(jù)，就只能根據(jù)漁藥生產(chǎn)企業(yè)提供的使用說明書選擇藥物和決定藥物的使用劑量。

　　

　　然而，致病菌對(duì)抗菌素類藥物的敏感性是可以隨著接觸其藥物次數(shù)而變化的，接觸某種抗菌素的次數(shù)越多，致病菌對(duì)這種抗菌素產(chǎn)生耐藥性就越強(qiáng)。楠田等（1988）在五條鰤（Seriola quinqueradiata）養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)分離大量的殺魚巴斯德菌（Pasteurella piscicida）菌株進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定結(jié)果表明，該菌對(duì)多種抗菌素產(chǎn)生的耐藥性程度是不相同的。楠田等（1976）利用離體培養(yǎng)的方法觀察P. piscicida對(duì)安比西林（ampicillin）和氯霉素（chloramphenicol）耐藥性獲得與消失速率的結(jié)果表明，P. piscicida在含有藥物的培養(yǎng)基中經(jīng)過10次傳代培養(yǎng)，供試菌對(duì)安比西林的耐藥性上升了4~8倍，而對(duì)氯霉素的耐藥性上升了4倍。在本研究中觀察了A.sobria對(duì)氟苯尼考耐藥性在離體培養(yǎng)過程中的變化，結(jié)果證明A.sobria在含有氟苯尼考培養(yǎng)基中經(jīng)過9次傳代后，供試菌株對(duì)氟苯尼考的耐藥性就上升了31倍。這究竟是因?yàn)锳.sobria容易對(duì)抗菌素藥物產(chǎn)生耐藥性還是氟苯尼考容易誘導(dǎo)A.sobria等水產(chǎn)動(dòng)物致病菌耐藥性的生成，尚值得進(jìn)一步研究。

　　

　　為了避免水產(chǎn)動(dòng)物致病菌產(chǎn)生耐藥性，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者在選擇抗菌素類藥物作為治療水產(chǎn)動(dòng)物傳染性疾病治療藥物時(shí)，應(yīng)該從患病動(dòng)物體內(nèi)分離致病菌并測(cè)定致病菌對(duì)擬選藥物的敏感性，只有在獲得各種抗菌素類藥物對(duì)致病菌的MIC的基礎(chǔ)上，漁藥的使用者才有可能作到正確選擇藥物和決定藥物的準(zhǔn)確用量，否則，就有可能因?yàn)椴恢�道致病菌�?duì)不同種類抗菌素耐藥性的變化背景，而造成實(shí)際上的盲目用藥。

　　

　　水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的傳染性疾病一旦發(fā)生，病程發(fā)展速度就比較快，而從患病魚體中分離病原菌并完成藥物敏感測(cè)定的試驗(yàn)是需要一定的時(shí)間的，養(yǎng)殖業(yè)者往往擔(dān)心做這樣的試驗(yàn)會(huì)貽誤對(duì)疾病治療的時(shí)機(jī)。為了防止這種情況的發(fā)生，養(yǎng)殖業(yè)者可以通過做好養(yǎng)殖日記的方法，避免將同類抗菌素類藥物在同一個(gè)養(yǎng)殖環(huán)境中多次使用，當(dāng)飼養(yǎng)的水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)生疾病時(shí)，可以選擇與以前選用的藥物不同而且致病菌不會(huì)產(chǎn)生交叉耐藥性的藥物；也可以在養(yǎng)殖過程中定期檢測(cè)養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)攜帶的致病菌對(duì)各種抗菌素類藥物敏感性的變化，只有掌握了養(yǎng)殖水體和水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)致病菌對(duì)各種藥物耐藥性的變化狀況，才有可能做到對(duì)癥用藥和科學(xué)用藥，否則，用藥種類的選擇、劑量的控制以及用藥程序的決定等就必然會(huì)帶有盲目性。（參考文獻(xiàn)略）【由江蘇省水產(chǎn)三新工程項(xiàng)目（編號(hào)：D2013-5-1）資助�！�