臺灣石斑虹彩病毒疫苗可望今年生產(chǎn)

農(nóng)委會主委陳武雄在2011年1月6日的獸醫(yī)師節(jié)慶祝大會上宣布，家畜衛(wèi)生試驗所研發(fā)的石斑魚虹彩病毒疫苗預(yù)計于今年取得制造許可。家畜衛(wèi)生試驗所初步已進(jìn)行田間試驗評估，并提出制造許可申請，在經(jīng)委托單位重復(fù)實驗確認(rèn)，取得制造許可后，即可開始生產(chǎn)了。

文/圖 《養(yǎng)魚世界》 鄭石勤

農(nóng)委會家畜衛(wèi)生試驗所可望于今年取得制造許可，圖為田間試驗正為龍膽石斑3吋苗注射虹彩病毒疫苗。

臺灣石斑魚苗的年產(chǎn)量高峰期在1999年，達(dá)2.8億尾，之后逐年降低，至2009年僅剩2千3百萬尾。臺灣石斑魚苗養(yǎng)殖業(yè)成長受限于石斑虹彩病毒及神經(jīng)壞死病毒（NNV）所感染，魚苗損失率高達(dá)七成。虹彩病毒會感染三十種以上的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類，石斑種苗之感染后的累積死亡率為50～90%。

虹彩病毒感染后主要是會造成造血織組壞死，主要病征會出現(xiàn)體色變黑、鰓蓋張開及鰓部出血的情況，傳染方式主要是以水平感染為主，這點(diǎn)與神經(jīng)壞死病毒可透過種魚垂直感染有很大的不同。目前石斑養(yǎng)殖業(yè)者對這兩種的病毒性疾病仍是無法預(yù)防與治療，能否獲利賺錢只有看發(fā)病后所留下的存活成數(shù)多少來決定。

負(fù)責(zé)疫苗研發(fā)的助理研究員黃淑敏在接受本刊專訪時表示，農(nóng)委會家畜衛(wèi)生試驗所自1991年開始針對水生動物進(jìn)行疾病監(jiān)測，經(jīng)過幾年監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，田間有好幾種海水養(yǎng)殖魚苗都有許多病原，主要是虹彩病毒及神經(jīng)壞死病毒（Nervous Necrosis Virus, NNV），這兩種病毒每年都有相同的疫情發(fā)生，在20種以上的魚種造成全身性感染，致使種苗業(yè)者嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

虹彩病毒科主要分成五個病毒屬，分別為Iridovirus、Chlorirdovirus、Ranavirus、Megalocystivirus及Lymphocystivirus，其中會造成魚類感染就屬前三種；而在魚類造成巨大經(jīng)濟(jì)損失分別為Ranavirus及Megalocystivirus，在臺灣已發(fā)現(xiàn)同時具有兩種病毒屬之存在，這兩種病毒屬皆會造成高的疾病發(fā)生率及死亡率。目前，家畜衛(wèi)生試驗所仍然每年都會在田間進(jìn)行病毒分離與監(jiān)測，臺灣主要流行的虹彩病毒株有三種基因型：GIV、RSIV及ISKNV。GIV為臺灣本土株（目前只于臺灣及東南亞有病例發(fā)生）；RSIV為親近于日本分離發(fā)表之病毒株；ISKNV為親近于中國大陸分離發(fā)表之病毒株。經(jīng)長期監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，近期的虹彩病毒與10年前的病毒在基因定序上差異不大，經(jīng)過幾年的檢測及分析后，黃淑敏認(rèn)為他們應(yīng)該可以再進(jìn)一步以研發(fā)疫苗來解決虹彩病毒對養(yǎng)殖上所產(chǎn)生的困擾。

虹彩病毒顆粒(家畜衛(wèi)生試驗所提供)

家畜衛(wèi)生試驗所花了一年才在44種佐劑中找到的最適當(dāng)配方，解決了疫苗乳化及保存的問題。

1995年起研發(fā)疫苗

自1995 年起，家畜衛(wèi)生試驗所開始著手進(jìn)行石斑魚的疫苗研發(fā)，黃淑敏說，要以疫苗為策略來控制疾病， 有些重要因素必須克服：第一，考慮疫苗之制程方法。因疫苗之制造方法又遷就于疫苗之成本及施予的方法；第二，選擇目標(biāo)魚種。以臺灣目前養(yǎng)殖之大宗魚類種別為主要考慮，前期規(guī)劃以青斑為主，后期加入龍膽石斑為標(biāo)的魚種；第三，選定疫苗株及種毒株。篩選具有免疫原性之疫苗株及具有宿主廣范圍感受性之種毒株；第四，疫苗安全性。選定對人類及魚類皆有安全性之配方；第五，疫苗之穩(wěn)定性及效力。測試疫苗之穩(wěn)定性及找出有效評估疫苗效力之方法。在上述開發(fā)疫苗之幾項前提要素，因有賴于家畜衛(wèi)生試驗所前副所長蘇杰夫以前開發(fā)石斑腎細(xì)胞株的重大貢獻(xiàn)，讓他們能夠利用已開發(fā)之細(xì)胞株進(jìn)行野外病毒分離、增殖及力價測定，且能短時間內(nèi)大量做體外復(fù)制病毒細(xì)胞，加速了而疫苗研發(fā)工作的進(jìn)展。

虹彩病毒種類在亞洲地區(qū)分布情況

測試佐劑配方耗時一年

家畜衛(wèi)生試驗所用化學(xué)藥劑殺病毒（一般用福爾馬林），這個步驟的關(guān)鍵是找出最適當(dāng)?shù)陌俜直�，能殺死病毒又不傷到魚。在制造出疫苗后的重點(diǎn)是佐劑，要能保存疫苗不讓力價損失。家畜衛(wèi)生試驗所在1996年花了一年的時間，在不同之制成及配方中找尋最適當(dāng)?shù)奶幹�，解決了疫苗乳化及保存的問題。關(guān)鍵點(diǎn)在疫苗與佐劑乳化后，力價要能穩(wěn)定，并且能有一定的保存時間。結(jié)果顯示：以腹腔注射混有佐劑B之疫苗，其保護(hù)指數(shù)為73%，混有MVP佐劑疫苗之保護(hù)指數(shù)只有50%，腹腔注射的免疫效果較肌肉注射效果為佳。

總共44個配方中，他找到了2～3個佐劑配方能讓疫苗保存一年�！该吭囈环N配方都要3～4個月的時間，才能知道效果好不好�！棺魟┡浞讲粚Φ脑�，乳化之后以4℃冷藏保存會產(chǎn)生分層現(xiàn)象，保存一年后7成的效果降到只剩4成。她說，已經(jīng)退休的前水試所生物科技研究中心研究員張正芳博士在這方面給了很多的協(xié)助，除了幫忙養(yǎng)魚以外，還有給毒、測試疫苗力價，幫忙評估疫苗效果。

克服了乳化技術(shù)后，隨即進(jìn)行基礎(chǔ)測試，了解最佳效果的劑量是多少。最初施打一劑，之后再攻毒，發(fā)現(xiàn)有時有保護(hù)力，有時又沒有。經(jīng)過反復(fù)的測試，在10公分青斑苗以0.1㏄劑量施注射一劑，14天后施打第二劑補(bǔ)強(qiáng)，就能夠給予青斑對虹彩病毒足夠的保護(hù)效果，而且無論注射2劑量或1劑量之試制疫苗對魚體都沒有不良反應(yīng)。

疫苗施打流程：1.麻醉

疫苗施打流程：2.疫苗注射

疫苗施打流程：3.置入放養(yǎng)池恢復(fù)

1999 年初步疫苗田間試驗

經(jīng)過了細(xì)胞培養(yǎng)、增毒、不活化及佐劑的四個疫苗研發(fā)必經(jīng)的程序之后，石斑虹彩病毒疫苗終于研發(fā)成功，來年在所里經(jīng)反復(fù)的實驗后，于1999年開始進(jìn)行田間試驗。但是事情并非想象中容易，家畜衛(wèi)生試驗所面臨找不到愿意配合進(jìn)行田間試驗之場主；為此，黃淑敏透過屏東縣家畜防治所徐所長的關(guān)系，才在屏東縣找到一個石斑魚中間育苗場協(xié)助做田間試驗，另外一個田間試驗場則是臺南黃姓業(yè)者主動透過臺南縣家畜疾病防治所找到了家畜衛(wèi)生試驗所，該所選定點(diǎn)帶及龍膽兩個石斑場進(jìn)行石斑魚虹彩病毒不活化疫苗田間試驗。在中間育成場里，他們選取2 吋半尺寸的健康石斑魚苗，每批試驗約5千尾，以腹腔注射第1劑量之疫苗后間隔14天，再補(bǔ)強(qiáng)接種第2劑之疫苗。注射疫苗后第3個月、第6個月、第9個月及第12個月購回免疫的魚只回到所里進(jìn)行效力試驗及代謝性評估。

同時也觀察田間實驗期間各組之存活率、注射安全性與體重和體長之生長情形，以評估疫苗使用與否對經(jīng)濟(jì)效益之差異。初步結(jié)果顯示，在注射疫苗之安全性評估部分：建議使用于大于10 克以上之石斑魚陰性場，而其注射方式及免疫流程如麻醉程度、恢復(fù)狀況，都需要經(jīng)過專業(yè)的訓(xùn)練和事前評估。

龍膽石斑的對照組與實驗組之存活率都是100%，不過實驗組的增重明顯優(yōu)于對照組，青斑經(jīng)免疫后11 個月，其存活率為74.6%；對照組之存活率為50%。在實驗室之效力評估：在龍膽石斑于免疫后3及6個月之疫苗效力是合格的，青斑于免疫后3個月之疫苗效力是合格的，免疫后6個月其對照組用最高之病毒力價攻毒已無法造成死亡。黃淑敏說，青斑此魚種對病毒較具抵抗性，放養(yǎng)6個月后就不怕病毒，抗病力比龍膽強(qiáng)。在實驗室里用強(qiáng)毒攻擊一樣大小的青斑及龍膽，青斑沒事，龍膽會發(fā)生死亡情形。

龍膽石斑中間育成因時間短獲利高，近年吸引了許多養(yǎng)殖業(yè)者相繼投入，即使有相當(dāng)程度的風(fēng)險，但投入挑戰(zhàn)的新建魚場時有所聞。圖為8~9公分的龍膽苗。

實驗室里注射過虹彩病毒疫苗的青斑苗，體色較青綠。

業(yè)者期盼疫苗帶來保佑

黃淑敏表示，試制疫苗于青斑及龍膽石斑之試驗場皆獲得有效之保護(hù)效果，除了魚只之存活率顯著優(yōu)于對照組之外，有施打本疫苗其體重增重皆優(yōu)于未施打者，這個結(jié)果與日本的報告結(jié)果吻合�！缸⑸湟呙绾蟮氖�斑苗食欲好，攝食量大，成長比較快，育成率也提高了，而且體色偏向青綠色，看起來健康有活力。」

目前家畜衛(wèi)生試驗所只作青斑及龍膽，其它的石斑魚種，因為未曾做過實驗，尚不得而知，但業(yè)者希望也能做虎斑的疫苗，因為虎斑的經(jīng)濟(jì)價值更高。

家畜衛(wèi)生試驗所研發(fā)的疫苗以注射方式施打，因此以室內(nèi)育苗池會較方便操作。根據(jù)估算，石斑疫苗的直接成本約2元，以注射方式施打，連工帶料的成本約3元。如果想給石斑苗較好的抗虹彩病毒能力，每條魚施打兩劑，要花成本約6元，這樣劃不劃算呢？據(jù)后續(xù)的私下了解，成魚養(yǎng)殖業(yè)者自田間試驗場購買青斑苗一萬余尾，并做了養(yǎng)殖對照觀察，施打疫苗組育成率7.5成，4,500尾售得74萬，未打疫苗的養(yǎng)殖組育成率5成，所得減少約24.7萬。也就是說，每尾魚以2劑6元成本計算，投資2.7萬元疫苗成本，多賣了22萬的額外利潤。

臺南的田間試驗場場主也表示，免疫過的龍膽苗飼料效益超乎想象中的好，連自己都不太敢相信。從3吋養(yǎng)殖1年可以長到4斤以上，成長速度真的很快，這是養(yǎng)殖魚類里很少見的，連海鱺都比不上。不過這可能也與其養(yǎng)殖設(shè)備有關(guān)聯(lián)，臺南田間試驗場是抽取地下海水，并加蓋溫棚，在冬季水溫都還可以維持在25～26℃。一般育苗場冬天的水溫會降到20℃左右，魚苗會停止攝食，生長也停下來，飼育的時間會拉長1～2個月。

業(yè)者表示，近年養(yǎng)殖龍膽石斑的業(yè)者都會遇到病毒的困擾，15公分到2～3斤的魚都還會因為感染虹彩病毒或神經(jīng)壞死病毒而死亡，造成損失，如果能有疫苗做防疫，增加石斑苗及成魚的育成率，會是養(yǎng)殖漁民的〝保佑〞。

如果能順利取得制造許可，家畜衛(wèi)生試驗所估計，其GMP廠每年最多能制造大約1百萬劑。根據(jù)漁業(yè)署的漁業(yè)年報統(tǒng)計，2009年臺灣石斑魚苗生產(chǎn)約2千3百萬尾，家畜衛(wèi)生試驗所的虹彩病毒疫苗年產(chǎn)1百萬劑，只能夠為50萬尾做免疫，施打率無法普及，未來可能會將疫苗生產(chǎn)技術(shù)移轉(zhuǎn)給民間企業(yè)。