| （福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學重點實驗室，福建師范大學生命科學學院，福建福州350108） 摘 要：多子小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis)和刺激隱核蟲(Cryptocaryon irritans)是兩種對魚類最具致命性的寄生性纖毛蟲, 分別引起淡水和海水魚類的“白點病”。多年來，該病給淡水和海水養(yǎng)殖造成了極大的經(jīng)濟損失。免疫學方法是防治“白點病”流行極具潛力并且具有諸多優(yōu)點的方法。目前尚無商業(yè)化疫苗出現(xiàn)。從“白點病”可能的疫苗開發(fā)方向出發(fā)對目前“白點病”的免疫防治研究現(xiàn)狀進行綜述，以期對未來的研究提供參考。 關(guān)鍵詞：多子小瓜蟲；刺激隱核蟲；白點��；免疫防治；疫苗 多子小瓜蟲和刺激隱核蟲分別俗稱淡水小瓜蟲和海水小瓜蟲。它們的生活史非常相似，都存在以下三個階段：寄生于宿主的滋養(yǎng)體階段、包囊階段、具有感染宿主能力的幼蟲階段。這兩種寄生蟲宿主范圍都很廣泛，能分別感染大多數(shù)淡水和海水魚類。感染了這兩種寄生蟲的魚，可以在其體表和鰓上看到“白點”。近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化程度的不斷提高、養(yǎng)殖密度的不斷加大，它們引起的問題日益突出，已造成極大的經(jīng)濟損失。目前主要采用物理和化學的方法進行防治，雖然起到了一定的效果，但它們都或多或少存在缺陷。如不適合大水體、效果不確定等，尤其是化學藥物對魚類的毒性、對環(huán)境的污染以及藥物殘留所引起的人類健康等問題，使這些方法備受質(zhì)疑。利用疫苗進行免疫防治，就不會存在這些問題。隨著各種魚類細菌、病毒疫苗的陸續(xù)上市，人們也希望開發(fā)出“白點病”疫苗。目前白點病疫苗研究主要涉足三個方向：全蟲疫苗、重組疫苗、DNA疫苗。與多子小瓜蟲相比，刺激隱核蟲在這些方面的研究相對比較滯后，它的很多研究思路都是借鑒多子小瓜蟲的。雖然目前的研究并不支持“刺激隱核蟲是多子小瓜蟲的海水對應種”這種說法，可能是這兩種生物趨同進化的緣故，它們的生活史、引起的病理特征、感染模式等許多方面都非常相似。所以在白點病疫苗開發(fā)過程中，任何研究成果在它們之間是可以共享和借鑒的。筆者在此對它們的疫苗研究現(xiàn)狀進行概述，其中也明析了研究中遇到的一些主要問題，希望能給白點病防治提供參考。 1 全蟲疫苗 針對這兩種寄生蟲，許多研究工作者用不同的全蟲材料感染或免疫魚類，評價其使魚類產(chǎn)生免疫保護的效果，得到的存活率、平均致死天數(shù)等數(shù)據(jù)不盡相同。這些差異的造成可能與魚的種類、全蟲材料種類、免疫的劑量以及免疫的方法有關(guān)。但總體而言，從這些研究中可以清楚地看出，全蟲材料可以使魚獲得免疫保護，其中無論采用浸泡感染還是腹腔注射，活的幼蟲效果是最好的，這就為用全蟲做疫苗提供了可能。用全蟲做疫苗，目前遇到的最大障礙是沒有足夠全蟲的持續(xù)供應，于是科研工作者們開始從不同角度解決這個問題。 1.1 多子小瓜蟲 解決全蟲供應問題的首要方法就是用易感染的魚作宿主，進行實驗室傳代。但隨著傳代循環(huán)的增加，小瓜蟲會出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，感染力逐漸下降，最終實驗種群消失。雖然Noe和Dickerson報道稱他們實驗室采用低溫9℃成功進行了傳代，延長了每個傳代周期的時間,減少了傳代的次數(shù)，在一定程度上減少了精力、財力的消耗，但并沒有解決衰老這個根本問題，在連續(xù)傳14代后，幼蟲感染力幾乎消失殆盡。Xu等通過對室溫條件下105個傳代循環(huán)的研究，指出當衰老跡象開始出現(xiàn)后，要逐漸加大實驗組中感染魚和未感染魚的比例，但并沒有后續(xù)的傳代報道，用此方法能否使傳代不斷進行下去仍是個疑問。 除了通過實驗室不斷傳代來滿足研究對寄生蟲材料的需求外，有人設(shè)想把包囊或幼蟲像細菌一樣保存起來，到實驗需要時，再通過實驗傳代大量獲取，這樣就避免了不斷傳代的麻煩。Everett等對玻璃化法低溫保存生物材料的程序進行優(yōu)化，此方法保存的部分多子小瓜蟲幼蟲解凍后仍具有正常的形態(tài)、大小和纖毛運動能力。 與四膜蟲相比，在野生環(huán)境中，小瓜蟲整個生活史的完成需要宿主參與。于是人們嘗試著不用魚做宿主對小瓜蟲進行體外培養(yǎng)。Ekless等對多子小瓜蟲各個時期的蟲體在細胞培養(yǎng)基上進行了短期培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基延長了蟲體的存活時間，但并沒有刺激幼蟲或滋養(yǎng)體的生長和進一步發(fā)育。Nielsen等在24孔細胞培養(yǎng)板中人工模擬了魚的上皮環(huán)境，不僅觀察到具有感染能力的幼蟲吸附到上皮細胞上，而且觀察到幼蟲到滋養(yǎng)體的發(fā)育、滋養(yǎng)體從36～46μm的生長，實驗顯示了魚的血清和粘液在這個過程中的重要作用。這在一定程度上說明小瓜蟲可以進行體外培養(yǎng)。 目前，在多子小瓜蟲體外培養(yǎng)技術(shù)尚不成熟的情況下，用其他寄生蟲刺激魚類的非特異性免疫來抵抗多子小瓜蟲感染的研究，也應引起注意。至少，它可以使魚建立起免疫保護，在一定程度上防止嚴重的白點病暴發(fā)。因為四膜蟲很容易在體外培養(yǎng)，這方面的研究，以用四膜蟲居多。這個策略最早是由Goven等采用， Dickerson等和Houghton也做了類似的免疫實驗，存活率有所改觀。Sigh等用福爾馬林固定的數(shù)量達6800只的四膜蟲腹腔注射褐鱒，3種四膜蟲都能使魚獲得免疫保護，同時發(fā)現(xiàn):與1種四膜蟲免疫的魚相比，3種四膜蟲混合免疫的魚體表滋養(yǎng)體的數(shù)目要少。 1.2 刺激隱核蟲 第1次涉及到刺激隱核蟲實驗室傳代的研究由Colorni進行。之后，Burgess、Yoshinaga、Dan等先后分別用鯔魚、茉莉花鳉、卵形鯧鲹作宿主成功進行了傳代。Dan建立的傳代方法每個循環(huán)的產(chǎn)量最高達到用于感染的幼蟲數(shù)的122倍，最低達61倍；一個循環(huán)從每條魚體上獲得的平均幼蟲數(shù)可多達100萬。而Burgess等獲得的數(shù)據(jù)最高是11.7倍；Yoshinaga等從每條魚身上僅得到50～500個滋養(yǎng)體。顯然Dan建立的傳代方法的產(chǎn)量要高很多，其原因可能與傳代所用宿主有很大關(guān)系。另外，幼蟲從包囊中出來后，其感染力隨時間是減弱的，Dan等用的是脫囊后2h的幼蟲，感染力會更強，這也可能是其獲得高產(chǎn)量的一個原因。 關(guān)于刺激隱核蟲的保存，Dan等采用了低溫法。滋養(yǎng)體和包囊在12℃可分別存活5個月和4個月。保存4個月的滋養(yǎng)體和保存3個月的包囊仍能產(chǎn)生具有正常感染力的幼蟲。研究還發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)體更適合保存。這個研究在一定程度上支持了冬季過后來年春季刺激隱核蟲來源的一種解釋：Dan等研究用的刺激隱核蟲的采集地在大亞灣，冬季最低氣溫11.5℃，12～15℃的氣溫至少持續(xù)30d，冬季水溫降低時，刺激隱核蟲滋養(yǎng)體脫離宿主，進入休眠狀態(tài)，來年春季，水溫升高，脫囊產(chǎn)生幼蟲，繼續(xù)感染宿主。 Yambot和Song用包含有寄生蟲吸附基質(zhì)的培養(yǎng)基對其進行體外培養(yǎng)實驗，不僅觀察到幼蟲吸附到胰酶大豆瓊脂塊固體基質(zhì)上，而且觀察到幼蟲到滋養(yǎng)體的轉(zhuǎn)變、生長。當把培養(yǎng)基中L15培養(yǎng)基含量從22.5%增加到30%、胎牛血清含量從2.5%增加到20%時，幼蟲雖沒有吸附在基質(zhì)上，但其轉(zhuǎn)變成滋養(yǎng)體之后，在培養(yǎng)基中反而得到更好的生長。因為沒吸附的寄生蟲更容易被收集，所以，如果幼蟲真可以不需要吸附而得到轉(zhuǎn)變和更好生長的話，那么這將極大方便刺激隱核蟲的體外培養(yǎng)。Yoshinaga等在2007年報道了刺激隱核蟲整個生活史的體外成功培養(yǎng)。收集到的幼蟲的感染力和正常宿主傳代相當，但不同培養(yǎng)批次在產(chǎn)量方面的穩(wěn)定性不太理想。目前，用其他纖毛蟲如四膜蟲來進行防治刺激隱核蟲感染的研究，還沒有相關(guān)的文獻報道。 2 重組疫苗 用多子小瓜蟲感染魚，魚血清在體外可以抑動多子小瓜蟲。一些與這種抑動現(xiàn)象有關(guān)的抗原——抑動抗原已經(jīng)鑒定出來。這些抑動抗原是多子小瓜蟲表面非常豐富的膜蛋白，它們是免疫反應的靶分子，可以作為多子小瓜蟲疫苗的候選分子。異源表達重組抑動抗原可以克服天然抗原供應問題，可以隨時根據(jù)實驗需要獲得。 2.1 用大腸桿菌作表達系統(tǒng) Clark等首次從多子小瓜蟲cDNA文庫中分離出抑動抗原IAG48A[G1]的部分cDNA片段并進行了相關(guān)的核苷酸序列和氨基酸序列分析。這些工作為異源表達抑動抗原提供了可能。He等構(gòu)建了一個長316bp的基因片段，其編碼48kDa抑動抗原的一個表位，并且在大腸桿菌中得到成功表達。用表達出來的重組抗原GST-iAg1免疫金魚，免疫組存活率優(yōu)于對照組，說明重組抗原GST-iAgI可以使魚對多子小瓜蟲產(chǎn)生免疫力。因為UAA和UAG這兩個密碼子在多子小瓜蟲和刺激隱核蟲基因中編碼的不是終止密碼子，而是谷氨酰胺，而且通常情況下，在一個基因中這兩個密碼子出現(xiàn)的次數(shù)也比較多，所以為了可以在大腸桿菌中表達，Lin等采用組合PCR合成了多子小瓜蟲抑動抗原基因IAG52A[G5]。去除信號區(qū)域的基因亞克隆到pGEX-6P-1表達載體上，得到高效表達。但無論用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠還是用鎳離子親和層析柱純化目標蛋白，效果都不理想。相關(guān)的魚免疫攻毒試驗也無法進行。因此Lin等提出了用細菌細胞裂解產(chǎn)物或全細菌細胞直接作為疫苗想法，但它們的有效性有待進一步研究。 2.2 用四膜蟲作表達系統(tǒng) 用真核生物四膜蟲作為表達系統(tǒng)的優(yōu)勢在于：同屬纖毛蟲的四膜蟲在密碼子偏好性上更貼近多子小瓜蟲，尤其是UAA和UAG這兩個密碼子在四膜蟲中編碼的也是谷氨酰胺。這樣可以避免大量誘變過程，減少實驗成本。 Gaertig等在1999年報道他們成功用四膜蟲表達了多子小瓜蟲抑動抗原IAG48A[G1]基因，表達產(chǎn)物定位于四膜蟲細胞表面。隨后，Shang等用MTT1啟動子成功過表達了多子小瓜蟲IAG48[G1]基因，該啟動子還可以極大增加DNA轉(zhuǎn)化的效率。用轉(zhuǎn)化后的四膜蟲活細胞處理魚，魚對這個血清型多子小瓜蟲感染產(chǎn)生了較強的免疫保護。然而，目前抑動抗原的表達都需要重金屬Cd2+誘導，體外實驗證明一定濃度Cd2+對滋養(yǎng)體也有致死作用的，所以就不清楚這個保護作用歸功于免疫反應還是Cd2+。Bisharyan等通過研究排除了Cd2+作用的可能。另外，Bisharyan等檢測到在魚免疫14d之后魚肌肉中Cd2+濃度是23ppb，這個濃度低于規(guī)定的魚產(chǎn)品中Cd2+的含量，略超出人體內(nèi)Cd2+正常范圍，而且隨著魚的繼續(xù)生長和排泄作用，這個濃度可能會進一步降低。盡管如此，重金屬Cd的使用還是會引起人們在環(huán)境和健康方面的擔憂。因此現(xiàn)在人們正在考慮相應的措施，進一步降低由重組四膜蟲疫苗帶來的重金屬Cd的濃度。 3 DNA疫苗 DNA疫苗是一種相對比較新的疫苗種類。優(yōu)勢在于它使用的是核苷酸序列，而不是抗原本身，不需要考慮抗原供應問題，而且它誘導的免疫保護能持續(xù)更長時間。目前，對魚類棒狀病毒的DNA疫苗研究已取得一些可喜的成果。用DNA疫苗肌肉注射鮭魚，魚肌肉細胞可以表達病毒蛋白并使它暴露于免疫系統(tǒng)中，致使免疫反應的發(fā)生，提高了鮭魚抵抗病毒的能力。Lin等把去除一段序列的抑動抗原基因IAG52A△C19[G5]連接到載體pcDNA3.1（+）上，用這個重組載體肌肉注射免疫斑點叉尾鮰，免疫魚的血清用Western blot檢測，抑動抗原AG52A[G5]免疫的魚血清作對照，結(jié)果顯示：實驗組出現(xiàn)了陽性信號，所在位置和對照基本一致。說明IAG52A△C19[G5]基因的確在魚肌肉細胞中得到了表達,并使魚產(chǎn)生了免疫反應，有特異性抗體生成。 目前，發(fā)現(xiàn)的多子小瓜蟲株分屬5種血清型（A、B、C、D、E）。除血清型D只表達一種抑動抗原外，其它均不止表達一種抑動抗原。這些抑動抗原大小40～70kDa。有關(guān)刺激隱核蟲的抑動抗原研究，也取得一定成果，已鑒定的抑動抗原或可能的抑動抗原的分子量分別為32kDa、37kDa、34kDa、40kDa，都小于多子小瓜蟲的抑動抗原。 32kDa和37kDa抑動抗原被確定來自兩種不同的血清型。34 kDa和40 kDa“抑動抗原”都來自刺激隱核蟲GD1。但不清楚后兩個與32kDa或37kDa抑動抗原是否來自同種血清型，所以刺激隱核蟲的血清型分類需要進一步完善。不管如何，Hatanaka等已分離出32和37kDa抑動抗原cDNA克隆，并進行相關(guān)的序列分析，這為異源表達刺激隱核蟲抑動抗原以及進行DNA疫苗研究帶來了希望。 另外，無論在多子小瓜蟲還是刺激隱核蟲研究中，都發(fā)現(xiàn)：（1）用全蟲材料免疫魚，不同血清型之間存在交叉免疫保護現(xiàn)象，且不同血清型之間的交叉免疫效果存在差異。（2）用抑動抗原免疫魚，免疫保護存在血清特異性。從這兩點，可以明顯看出，還有其他表面或分泌抗原在魚的免疫反應中發(fā)揮作用。關(guān)于其他有可能作為候選疫苗的抗原，Lokanathan等在其論文中有詳細的分析。這樣，重組疫苗和DNA疫苗的應用可能不只限于抑動抗原，也許將來會用幾種重組疫苗或DNA疫苗來聯(lián)合抵御病害。在刺激隱核蟲的免疫研究中，發(fā)現(xiàn)刺激隱核蟲免疫魚的血清和皮膚粘液的抑動效價遠比同樣劑量的多子小瓜蟲免疫的要低得多，原因可能是刺激隱核蟲表面的抑動抗原沒有多子小瓜蟲的豐富或刺激隱核蟲表面抗原的免疫原性并沒有多子小瓜蟲強，也可能是，雖然免疫魚產(chǎn)生很好的免疫反應，但刺激隱核蟲的游動速度更快，纖毛更健壯，產(chǎn)生的抗體不容易阻止纖毛運動。所以在刺激隱核蟲的免疫防治中，更有可能需要幾種重組疫苗或DNA疫苗的聯(lián)合作用。 4 結(jié)語 白點病已引起水產(chǎn)養(yǎng)殖極大的經(jīng)濟損失，免疫防治被寄予厚望。正如Medzhitov所言，對于宿主生物，重要的不是被誘導的免疫反應本身，而是產(chǎn)生的免疫反應能否對特定的病原感染起到保護作用。無論用多子小瓜蟲或刺激隱核蟲自然感染還是人工免疫，都已證實了這兩種寄生蟲可以刺激宿主魚產(chǎn)生保護性免疫反應，這就為開發(fā)疫苗對白點病進行免疫防治奠定了很好的基礎(chǔ)。關(guān)于其中保護機制的研究，目前主要集中于特異性抗體，但仍有諸多問題需要解決。所以在白點病疫苗開發(fā)的道路中，除了文中提到的一些問題需要解決外，為了最佳抗原、最佳免疫佐劑以及最佳免疫程序的選擇，需要進一步闡釋其中的免疫保護機制。（鄭昌峰） 【關(guān)鍵字】：魚類 “白點病” 免疫防治 研究進展 水產(chǎn)養(yǎng)殖 水產(chǎn)新聞 中國水產(chǎn)網(wǎng) |
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