牙鲆彈狀病毒實現(xiàn)快速分離鑒定

    由山東、遼寧和深圳檢驗檢疫局技術人員聯(lián)合展開科研攻關的“牙鲆彈狀病毒的病原學研究、快速檢測方法的建立及疫情普查”課題獲得2011年國家質(zhì)檢總局“科技興檢”二等獎。該技術為我國出口石鰈、牙鲆、大菱鲆等魚類產(chǎn)品提供了有力的技術支撐，創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟、社會和生態(tài)效益。

實驗室工作人員進行細胞培養(yǎng)試驗

       我國是漁業(yè)生產(chǎn)大國，水生動物貿(mào)易在我國進出口貿(mào)易中占有重要的地位。但是近年來， 從國內(nèi)到國外，水生動物養(yǎng)殖病害普遍加重，嚴重威脅著環(huán)境、食用、漁業(yè)經(jīng)濟的安全以及水生動物貿(mào)易的發(fā)展。鑒于日益嚴重的養(yǎng)殖病害，世界各國都加強了對出入境水生動物疫病疫情的檢測。

       迫在眉睫

       韓國是我國水生動物貿(mào)易的主要出口國家，根據(jù)國家質(zhì)檢總局與韓國海洋水產(chǎn)部簽訂的《中韓進出口活水生動物檢驗檢疫協(xié)議》，在進出境的養(yǎng)殖和種苗用水生動物中，對于鱸魚、真鯛、大菱鲆、牙鲆等要進行牙鲆彈狀病毒（HRV）的檢測。但是，HRV尚未列入世界動物衛(wèi)生組織（OIE）水生動物病害名錄中，缺少相關國際組織推薦的檢測方法。在我國，HRV相關的文獻報道較少，也沒有檢測HRV的行業(yè)標準和國家標準。韓國的這一技術性貿(mào)易措施嚴重影響了我國的魚類出口貿(mào)易，給企業(yè)和國家造成了損失。因此，開展HRV的研究并建立其檢測方法迫在眉睫。

       聯(lián)合攻關

       鑒于此形勢，由山東、遼寧和深圳檢驗檢疫局的技術人員聯(lián)合展開科研攻關。2008年，從山東榮成某魚苗場的石鰈（Kareius bisoloratus）中檢測到了牙鲆彈狀病毒核酸（HRV），并通過EPC和FHM細胞系分離到病原，經(jīng)過對理化特性、生物學特性進行鑒定，確認為牙鲆彈狀病毒，這是國內(nèi)首次分離到該病毒。為了對該病原進行深入的研究，滿足《中韓進出口活水生動物檢驗檢疫協(xié)議》的要求，有效地防范國外水生動物病原傳入傳出我國，保護和促進我國對外貿(mào)易的發(fā)展，國家質(zhì)檢總局支持了“牙鲆彈狀病毒的病原學研究、快速檢測方法的建立及疫情普查（2009IK002）”的科研課題立項工作。

       經(jīng)過3年的刻苦攻關，項目組開展了對牙鲆彈狀病毒的病原學研究，利用RACE技術對HRV的全基因序列進行了測定并比較了與韓國分離株的遺傳信息的差異；建立了牙鲆彈狀病毒（HRV）的檢測方法，包括病毒分離鑒定方法、常規(guī)RT-PCR、實時定量RT-PCR和LAMP等分子生物學方法；制備HRV的單克隆抗體，建立HRV的ELISA等免疫學檢測方法，為快速診斷提供技術支持，同時對建立的快速檢測方法進行了應用并進行了評估，為制定HRV檢疫操作規(guī)范的行業(yè)標準和國家標準提供理論依據(jù)。該項目獲得2011年度國家質(zhì)檢總局“科技興檢”二等獎。

       快速檢測

       隨著經(jīng)濟全球化進程的加快，我國水生動物的進出口貿(mào)易迅速增長，為了保護我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和水生動物貿(mào)易的健康發(fā)展，必須對出入境魚類進行嚴格的檢驗檢疫，并對國內(nèi)養(yǎng)殖場的魚病進行監(jiān)測及流行病學調(diào)查，因此亟須建立方便快捷、穩(wěn)定可靠、靈敏度高、特異性好的檢測方法。水生動物是低等脊椎動物或無脊椎動物，其免疫反應能力很低，很不穩(wěn)定，其血清學反應不像哺乳動物那樣有規(guī)律，因此在某種程度上增加了水生動物疫病診斷的難度。

       隨著分子生物學技術和免疫學技術的發(fā)展，檢測水平不斷提高和檢測方法日益多樣化，對于病原體的診斷技術提出了快速、靈敏、準確、特異的要求。病毒分離鑒定是通過細胞培養(yǎng)分離病毒，然后用免疫學方法或者分子生物學方法進行進一步的確認，這是檢測魚類病毒的“黃金標準”。PCR技術由于其簡便、快速、靈敏，已廣泛應用于魚類病原的檢測，OIE的很多魚類病毒的診斷方法中，都推薦PCR作為初篩方法。實時定量RT-PCR方法快速、靈敏、準確，可以對病毒進行定量檢測。由于LAMP技術的靈敏性、特異性、快速性和超低成本的特點，不需要大型儀器，尤其適合大量、即時、現(xiàn)場的病原檢測。雙抗夾心ELISA檢測HRV的方法，作為HRV檢測的重要的免疫學技術，與分子生物學檢測方法互為補充。本項目針對不同的檢測目的和檢測要求，建立了牙鲆彈狀病毒的病毒分離鑒定、快速分子生物學以及免疫學的快速檢測平臺，這是國際上動物病原檢測的主要的技術方法。

       效益巨大

       牙鲆彈狀病毒的檢測方法，得到了國內(nèi)同行的驗證，經(jīng)推廣，應用于出入境檢驗檢疫、養(yǎng)殖場、漁業(yè)部門、進出口企業(yè)等部門，如珠海出入境檢驗檢疫局，天津出入境檢驗檢疫局、上海出入境檢驗檢疫局、廣東出入境檢驗檢疫局、山東農(nóng)業(yè)大學、中國海洋大學、江西省水產(chǎn)品安全質(zhì)量檢測中心、廣東省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所、威海安順水產(chǎn)食品有限公司、威海中騰進出口有限公司、威海聚海貿(mào)易有限公司等。本項目在實際應用中，可對水生動物疫病進行快速檢測和疫病疫情監(jiān)控，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早隔離；可以有效防止水生動物疫病蔓延，保護我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展；有利于消除技術性貿(mào)易措施，促進水生動物貿(mào)易的發(fā)展；為制訂水生動物疫病檢測的行業(yè)標準和國家標準提供材料。目前已節(jié)約檢測成本1000多萬元，創(chuàng)造經(jīng)濟效益2000多萬元。經(jīng)過國內(nèi)同行的驗證、推廣，監(jiān)控區(qū)域內(nèi)牙鲆彈狀病毒的病害明顯減輕，發(fā)病率低，同時大幅減少了獸藥的使用量，促進了我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，動物流行病學調(diào)查是防治疫病的重要途徑，該研究利用建立的HRV檢測方法，對我國海域的224份主要海水養(yǎng)殖魚類樣品進行了HRV的檢測，為HRV的防控提供了寶貴的流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)，為HRV的防控實現(xiàn)預警和應急反應奠定了重要的工作基礎。本項目對于認識水生動物病毒的基因組結構與功能、研究水生病毒與宿主的相互作用、了解該病毒與其他魚類彈狀病毒的關系等方面有較為重要的意義。

       □ 于立欣