淡水魚病毒性疾病的研究進(jìn)展

在中國，淡水魚是水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要魚類之一，不但是主要食用魚類之一，而且許多品種還是供觀賞的，比如色彩艷麗的錦鯉。淡水魚類會受到各種致死性疾病的侵襲，致死性疾病包括病毒性疾病、細(xì)菌性疾病和寄生蟲疾病。病毒病原微小，感染動物后便在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，抗菌素對病毒幾乎不起作用，而化學(xué)藥物在滅活病毒前就可能對宿主細(xì)胞產(chǎn)生損害。尤其在每年的春秋季節(jié)，是魚類病毒性疾病的多發(fā)季節(jié)，因為水溫是最適合病原生長繁殖的。同時，病毒性疾病具有潛伏期長短不一，發(fā)病癥狀復(fù)雜多變，傳染性強，死亡率高的特點。1998年在美國和以色列暴發(fā)的大規(guī)模鯉魚死亡，經(jīng)實驗室剖檢和分子生物學(xué)診斷，確定這些鯉魚是感染錦鯉皰疹病毒引起的。在20世紀(jì)80-90年代期間，中國曾經(jīng)報道過魚類傳染性胰腺壞死病的暴發(fā)，引起鮭科魚類的大量死亡，給鮭科魚類的養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。因此，增強魚類病毒病的認(rèn)識，了解魚類病毒病的最新研究情況，為深入開展科研工作提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1  流行情況

    隨著近幾十年水產(chǎn)業(yè)在全世界的快速發(fā)展。有關(guān)淡水魚病毒性疾病的報道開始出現(xiàn)，早在1967年發(fā)現(xiàn)的一種虹鱒魚病毒病—傳染性造血器官壞死癥，當(dāng)時是沿著太平洋沿岸流行傳播的，隨著國際貿(mào)易交往的增多，美國、日本等國家也先后暴發(fā)了此病，也造成了巨大的損失。其他的淡水魚病毒性疾病也在隨后的幾十年有過報道，傳染性胰腺壞死病和病毒性出血性敗血癥也是發(fā)現(xiàn)較早的病毒性疾病，先后在國外得到確診，并于不久后傳播進(jìn)入中國境內(nèi)，即1984-1989年，在中國檢測并診斷到傳染性胰腺壞死病。病毒性出血性敗血癥也在這段時間傳播進(jìn)入中國，在中國的局部地區(qū)暴發(fā)流行，在1995年，此病主要在北美洲和歐洲的一些國家暴發(fā)流行，給當(dāng)時的國際水產(chǎn)貿(mào)易帶來了重大的影響。流行范圍比較廣泛的鯉春病毒血癥病毒最初是由Fijian等分離得到的，此病最初只是在歐洲的大部分地區(qū)流行，后來陸續(xù)在巴西、美國、加拿大、中國報道過，在中國還沒有大范圍的暴發(fā)流行過，它給世界養(yǎng)魚業(yè)和漁業(yè)市場帶來的經(jīng)濟損失是不可估量的，SVC已被OIE列為必須申報的疾病，中國農(nóng)業(yè)部也將之列為《中華人民共和國進(jìn)境動物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》中的二類動物疫病。

    下面介紹一種影響更大的淡水魚病毒性疾病的流行情況錦鯉皰疹病毒病。此病自從以色列和德國報道第一例以來，KHV的分布范圍變得越來越廣泛，從相關(guān)的報道和出版的文獻(xiàn)來看，KHVD最少覆蓋了包括中國在內(nèi)的22個不同的國家，歐洲的奧地利、比利時、丹麥、法國、意大利、盧森堡、荷蘭、波蘭、瑞士和英國。亞洲的一些國家：中國(香港)、中國臺北、印度尼西亞、日本、馬來西等國家。此外，美國也報道了KHV疾病的發(fā)生。事實上KHV疾病流行的國家可能要更多，只是暫時還沒有報道或尚未確定。此病的死亡率高達(dá)80%～100%，死亡較快，一旦暴發(fā)流行，將給魚類養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失。

2  國內(nèi)外研究進(jìn)展

    隨著世界各國漁業(yè)養(yǎng)殖的規(guī)�；�和國際貿(mào)易交流的增加，國內(nèi)外對淡水魚的病毒性疾病的研究也在逐漸增多。國外科學(xué)家對病毒性疾病的研究起步較早，中國對病毒病的研究還處在起步階段，病毒的一些生物學(xué)特性、基因序列的分析和蛋白的功能方面的工作還尚未開展。

    以錦鯉皰疹病毒病為例。之前各個國家對它的認(rèn)識還很局限，尤其是以水產(chǎn)業(yè)作為國家支柱產(chǎn)業(yè)的國家，此病的死亡率高、傳播速度快、發(fā)病時間短、暴發(fā)范圍廣等特點，給這些國家的漁業(yè)養(yǎng)殖帶來了無法彌補的經(jīng)濟損失，讓養(yǎng)殖者、錦鯉愛好者和魚類零售商重新審視了錦鯉皰疹病毒病，并加強了對此病的監(jiān)控與管理，隨后在東京的河水中檢測到了KHV，此病在野外的暴發(fā)給監(jiān)管部門的管理帶來了更大的阻力和障礙，再次敲響了警鐘。錦鯉皰疹病毒的致病機制還在研究的初級階段，有研究人員提出過這樣一種假設(shè)：遭受錦鯉皰疹病毒粒子感染的鯉魚或錦鯉，它們污染過的水里可能存在的病毒粒子可以通過鰓進(jìn)入魚體內(nèi)，病毒粒子在魚體內(nèi)進(jìn)行大量復(fù)制，同時導(dǎo)致表皮黏膜腐敗和壞死。然后病毒粒子快速的從鰓傳播到腎，誘導(dǎo)間質(zhì)性腎炎，最終誘導(dǎo)健康魚發(fā)病；另一種說法是病毒通過表皮脫落或腐敗的方式釋放到水中，在經(jīng)過鰓侵入魚體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，再把病毒粒子釋放到水中，以此重復(fù)循環(huán)感染魚體。Costes等學(xué)者也證實了病毒粒子主要是通過皮膚感染進(jìn)入魚體內(nèi)的。   

    目前，其他幾種病毒病的致病機制已經(jīng)很清楚了，傳染性胰腺壞死病和病毒性出血性敗血癥等疾病已經(jīng)得到了有效的控制，國際動物衛(wèi)生組織已經(jīng)公布了標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，供各檢驗檢疫部門參考使用。   

3  病原學(xué)研究   

    目前，大多數(shù)淡水魚病毒病的病原都是確認(rèn)的，基因組的大小及病毒的結(jié)構(gòu)特征基本得到了統(tǒng)一。但也有個別例外，錦鯉皰疹病毒是否屬于皰疹病毒還存在爭議，Pikarsky等研究得出結(jié)論，KHV基因組大小明顯大于皰疹病毒基因組的大小，不應(yīng)屬于皰疹病毒科，更確切的命名應(yīng)為鯉魚腎炎鰓壞死病毒，也有人提出了相反的意見，Waltaek等也證明了該病毒分類屬于皰疹病毒，并且在命名了其他兩種鯉科病毒后將其命名為鯉科病毒3(CyHV-3)。Aoki等也描述了KHV的基因組序列全長295k bp，包括長22k bp的末端重復(fù)序列，在皰疹病毒科里，此病毒基因組是最大的。并且鑒定了156個特異編碼蛋白的基因，認(rèn)為KHV全基因組的15個基因與IcHV-1基因有同源性，也為KHV屬于皰疹病毒科提供了充分有力的證據(jù)。   

4  病毒病的檢測與診斷   

4.l  病原的分離鑒定—細(xì)胞培養(yǎng)   

    利用不同的敏感宿主細(xì)胞系分離和純化病毒，后利用病毒中和試驗(NT)、免疫熒光試驗(IF)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等方法中的一種確診。這是一種傳統(tǒng)的、可靠的檢測方法，但此方法受諸多因素的限制，一是淡水魚細(xì)胞生長周期較長，對溫度有苛刻的要求，一般20℃左右是魚細(xì)胞生長的最適溫度；二是有些魚的敏感宿主細(xì)胞較難制備或沒有商品化的細(xì)胞系出售，比如錦鯉皰疹病毒的最適生長細(xì)胞系，是鯉魚鰭條細(xì)胞系(KF-1)和鯉魚腦細(xì)胞系(CCB)，很難制備出高質(zhì)量的敏感細(xì)胞系；三是培養(yǎng)魚細(xì)胞系所需費用較高，不適合科研經(jīng)費很緊張的科研院校和研究所使用。所以利用細(xì)胞分離鑒定病毒不適和推廣到基層，而且此方法的敏感性也不如PCR方法。

4.2  血清學(xué)實驗

    血清學(xué)檢測技術(shù)包括中和實驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、對流免疫電泳、瓊脂擴散實驗、熒光抗體技術(shù)等技術(shù)。中和試驗是檢測魚類病毒病的經(jīng)典檢測方法，目前已廣泛應(yīng)用于IPNV、SVCV、IHNV等病毒的常規(guī)檢測中。熒光抗體技術(shù)已經(jīng)在IPNV、SVCV、IHNV等病毒性疾病的診斷中應(yīng)用，國外有科學(xué)家應(yīng)用此技術(shù)檢測KHV的存在與否。ELISA技術(shù)也成功應(yīng)用到IPNV、SVCV、IHNV、KHV的實驗室診斷中，此方法對抗體要求較高，需要的單克隆抗體要經(jīng)過純化，且抗體效價要求較高，因為有些病毒易產(chǎn)生非特異性抗體，易與其他的魚類病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)，影響診斷的可靠性。所以，這也限制了ELISA技術(shù)在臨床診斷的推廣應(yīng)用。

    總體來看，制備高效價的單克隆抗體是ELISA技術(shù)成功的關(guān)鍵因素，單克隆抗體可以更準(zhǔn)確、有效地進(jìn)行診斷，避免非特異抗體的干擾。目前中國已經(jīng)成功制備出鯉春血癥病毒的單克隆抗體，還未見到有成品銷售，其他魚類病毒病的單克隆抗體市場上銷售的也不多見。

4.3  分子生物學(xué)方法

    利用分子生物學(xué)的方法檢測病毒粒子的存在是一種新的研究趨勢，也在逐漸發(fā)展壯大起來。應(yīng)用較多的分子生物學(xué)的檢測與診斷方法包括PCR檢測技術(shù)、熒光定量PCR檢測技術(shù)，巢氏PCR檢測技術(shù)等。而PCR檢測技術(shù)是應(yīng)用最多的檢測技術(shù)，因為此方法有特異性高，敏感性高，檢測結(jié)果可信度高，省時省力是實驗室檢測與診斷的最優(yōu)選擇。

    目前，國家公布的檢測錦鯉皰疹病毒的標(biāo)準(zhǔn)就是PCR檢測技術(shù)，這種方法是從病魚的新鮮組織器官樣品中檢測KHV DNA最為敏感的檢測方法。該規(guī)程同樣適用于檢測具有亞臨床癥狀的病毒。最早應(yīng)用TK探針發(fā)展該規(guī)程的是以色列希伯來大學(xué)的Bercovier等，而后是日本水產(chǎn)養(yǎng)殖自然研究所(NRIA)的Yuasa等人，并且經(jīng)過了Gray等的改良后發(fā)表。若是組織樣品有腐爛跡象，則應(yīng)用探針位點靶向基因組的稍短區(qū)域，正如Hutoran等所研究的那樣�；蛘邞�(yīng)用已公開發(fā)表的引物來對KHV基因組中更短的靶序列進(jìn)行擴增。段宏安等應(yīng)用PCR檢測技術(shù)成功的從有臨床癥狀的錦鯉中檢測到KHV，孟慶峰等也利用PCR方法檢測到了錦鯉皰疹病毒的TK、Sph、ORF7 3個主要靶基因。鯉春病毒血癥病毒的檢測與診斷應(yīng)用到熒光RT-PCR和PCR，但還沒有包括到OIE已公布的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法中。病毒性出血性敗血癥病毒及傳染性胰腺壞死病毒等病毒的檢測也都有PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR、熒光探針等檢測方法的應(yīng)用。

4.4  LAMP(loop-mediated isothermal amplificatiOn，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù))

    LAMP是一種快速的診斷病毒或細(xì)菌核酸的新技術(shù)。在等溫條件下，LAMP反應(yīng)能快速的擴增核酸，具有高特異性和有效性等特點。到現(xiàn)在為止，Lamp技術(shù)在魚病毒的檢測中，應(yīng)用的還比較少，在KHV的檢測中已經(jīng)應(yīng)用了LAMP檢測方法，Mansour應(yīng)用lamp技術(shù)在短時間內(nèi)就可以檢測發(fā)病樣本，而且在加入熒光染料的反應(yīng)體系內(nèi)，肉眼就可以看到顏色的變化，大大縮短了檢測時間。也有應(yīng)用RT-LAMP檢測傳染性胰腺壞死的，其檢測病毒核酸的最低量達(dá)到0.001fg，檢測時間縮短到1h，但是這種方法還沒有推廣使用。

5  疾病的防治

5.1  疾病的預(yù)防

5.1.1  疫苗的制備一般來說，活疫苗對機體的免疫系統(tǒng)一直都有免疫刺激作用，能夠誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫同時發(fā)生，刺激發(fā)生局部反應(yīng)和全身性的均衡，而活的弱毒疫苗對免疫魚的效果特別顯著。以色列的科學(xué)家通過KF細(xì)胞的傳代，獲得非致病或致病力很弱(不會導(dǎo)致接種錦鯉死亡)的錦鯉皰疹病毒弱毒毒株，將此弱毒接種健康錦鯉，可以有效的保護(hù)免疫錦鯉不受病毒的攻擊。由此可以看出，弱毒疫苗的生產(chǎn)對于水產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有很大的影響。然而在其他的幾種淡水魚病毒病中，疫苗的制備還處在經(jīng)典方法的應(yīng)用階段，還有大量的研究工作有待開展。最近幾年相繼面世的基因工程疫苗，核酸疫苗已經(jīng)在人類病毒病防治中得到應(yīng)用，這為水生動物病毒病的免疫治療提供了借鑒，同時活的弱毒疫苗的研究是未來發(fā)展的方向。

5.1.2  預(yù)防措施

    (1)嚴(yán)格執(zhí)行撿驗檢疫制度。對于可疑的魚苗堅決不引進(jìn)；(2)在魚苗入池后，盡快調(diào)節(jié)池水溫度。錦鯉皰疹病毒在23～28℃是最易發(fā)病的溫度，水溫保持在18℃左右可以減少發(fā)病幾率，也不會對魚的生長造成影響；(3)在流行過此病的地區(qū)改養(yǎng)對該病不敏感的魚類，而且放養(yǎng)前要對水池徹底清理，入池前的魚苗要經(jīng)過嚴(yán)格的篩選和消毒；(4)使用的工具及運輸車輛要定期消毒；(5)餌料中要富含魚苗生長所需的各種營養(yǎng)成分，以提高魚體的免疫力；(6)合理的換水增氧，尤其在陰雨天或是冬季，保持魚塘內(nèi)有充足、新鮮的氧氣；(7)養(yǎng)殖密度不宜太大；(8)加強日常管理，做到每天都觀察魚體活動情況，并做好記錄；(9)發(fā)現(xiàn)疑似病魚要盡快隔離，立即上報，并送相關(guān)部門確診。

5.2  疾病的治療

    (1)治療方案。開啟增氧機，減少投喂量，提高魚體免疫力�？梢允褂谩氨趟�爽”、“凈水寶”、“優(yōu)碘”等進(jìn)行潑灑消毒，有較好的治療效果，用量要根據(jù)發(fā)病的實際情況而定；(2)消毒。對于養(yǎng)殖人員、車輛及使用的工具要進(jìn)行嚴(yán)格管理，并做好消毒工作，防止病原的擴散。

6  小結(jié)

    占人有這樣一句話“防大于治”，它對于淡水魚病毒性疾病也同樣適用，所以淡水魚病毒性疾病的預(yù)防顯得尤為重要，要怎么預(yù)防成了關(guān)鍵因素。對于病毒病目前還沒有特效預(yù)防藥。而專家們也一致反對濫用藥物，認(rèn)為那樣不僅會降低魚等水生動物的肉質(zhì)質(zhì)量，并留下殘留的毒性，還會降低動物自身的抗病能力，污染水體環(huán)境。所以制備高效價的疫苗是預(yù)防淡水魚病毒性疾病的有效措施。從疫苗的研究情況看，滅活疫苗、減毒疫苗、細(xì)胞工程疫苗等對草魚出血病的防治已做出重要貢獻(xiàn)，對于其他水生動物，疫苗的制備與使用還處于不成熟階段，還有大量工作有待展開。像錦鯉皰疹病毒到目前為止，國內(nèi)只有組織滅活疫苗的研究，效果還不是十分理想，該病的較有效的疫苗是通過變溫的方法或在敏感細(xì)胞上連續(xù)傳代獲得非致病的突變株，作為弱毒疫苗免疫錦鯉和鯉魚，免疫保護(hù)率可達(dá)80%以上。但是弱毒疫苗存在易返祖和不易保存等缺點，還需要研究更加安全有效的基因工程疫苗，如DNA疫苗、基因工程亞單位疫苗、載體表達(dá)口服疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗等，是未來魚類疫苗研究的發(fā)展方向。

    淡水魚病毒性疾病藥物治療應(yīng)用的較少，進(jìn)展緩慢，無高效的藥物，一般的研究都停留在魚體外細(xì)胞的抗病毒水平上，實際應(yīng)用到體內(nèi)的治療水平還不夠，一般的抗病毒藥物對魚類存在一定的毒性作用，研制無毒害的防治藥物是今后發(fā)展的方向。

    錦鯉皰疹病毒病、傳染性胰勝壞死病毒病、傳染性造血器官壞死癥及病毒性出血性敗血癥的致病機制還不是很清楚，國內(nèi)對此病的研究還停留在初步階段，部分魚類病毒的基因組結(jié)構(gòu)已經(jīng)闡明，其基因編碼蛋白的方式、基因表達(dá)的調(diào)控等有待進(jìn)一步研究，并應(yīng)用到定向抗病毒育種、抗病毒藥物篩選等技術(shù)上。

    作者單位：(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，長春 130118；2.吉林出入境檢驗檢疫局，長春 130062)